金华蔡司激光金华共聚焦显微镜作为生命科学实验最常用的仪器之一，几乎会出现在每个生命科学研究者的“ Materials and Methods ”中。金华蔡司激光金华共聚焦显微镜 LSM 7/8/9 系列以其高质量的成像结果深受生命科学科研工作者的喜爱，成为了蔡司的“明星产品”。

　　随着科研手段的不断升级，激光金华共聚焦显微镜也在不断满足我们越来越多的多维成像需求。但是，我们在实际操作时，难免会因为样品 “罢工”，遇到一些抓狂时刻：

　　三维重构时发现关键层缺失

　　大图拼接有拼缝/阴影

　　时间序列拍摄时发现荧光信号越来越弱

　　今天蔡司君带您解锁激光金华共聚焦显微镜在进行多维成像时，设置不同扫描策略的技巧。

　　三维重构策略：Z-Stack

　　① 选择Z轴扫描的范围。软件中提供了 First/Last 和Center 两种不同的设定模式。其中，First/Last，可以更直观的确定样品的上/下表面，保证拍摄范围的完整性;Center 模式，将感兴趣的信号设置在 Z 轴的中心。两种设定模式可以根据实际需求灵活选择

　　② Z轴步进。如果对重构结果Z轴视角有更高的精度需求，我们可以点击 Optimal 使用系统推荐步进，获得更好的重构效果;如需减少漂白/加快速度，我们也可在Interval 输入合适的数值;当我们设置的 Interval>Optimal 的 2 倍，则有可能出现上述提到的关键层缺失问题

　　③ 亮度矫正。对于一些比较厚的样品，拍摄时可能发生拍得越深亮度越暗的现象，这时可以使用 Auto Z Brightness Correction，对于物镜远端的样品给予更高的laser power 和Master Gain

　　④ 速度优化。对于多色样品三维重构，使用 Full Z-stack per Track 采集顺序，可提高整体采集速度哦

　　⑤ 拍摄结果。软件左侧工具栏，3D 功能可以查看或导出渲染结果;Ortho 则可以获取更大强度投影

　　大图拼接策略：Tiles

　　① 对于焦面不一致的图像拼接，可调用 Focus Surface and Support Point 功能

　　② 拼缝是拼图中的正常现象，我们拼图设置会默认tile之间存在 10% 的 overlap。拼图后，使用 Stitching 功能，软件会帮我们一键消除拼缝

　　③ 如果拍摄结果出现规律的阴影，可使用软件的阴影矫正功能。(先 Shading reference for processing 提取阴影，后在 Stitching 中进行 Correct Shading，并在 Reference 中勾选上一步提取的 Shading 文件)

　　时间序列策略：Time series

　　① 设置拍摄时长。根据实验需要输入合适的循环数，或总体拍摄时间

　　② 设置合适的间隔时间。即 Interval(间隔时间包含拍照的时间)

　　③ 选择对焦策略。在 Focus Strategy 中选择 Software Autofocus / Definite Focus

　　合适的聚焦策略可以帮助我们有效的防止长时程拍摄中焦面的漂移。但荧光信号渐弱，也有可能是因为荧光淬灭，可以适当降低激光功率哦。